Que es el PCR – Reacción en cadena de la polimerasa

Author: hepato | Date: July 16, 2007 | Please Comment!

Reacción en cadena de la polimerasa

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La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Termociclador

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (94 ºC en algunos momentos) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador.

Técnica [editar]

Para realizar la técnica se necesitan:

Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (no más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
Iones de magnesio (Mg ²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. Éste es un cofactor de la polimerasa.
Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas (la más común es la Taq polimerasa). También llamado DNA problema
ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada paso del ciclo.

Ciclo de amplificación

La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 minutos, en el cuál se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo. Posteriormente tiene tres pasos que se repiten muchas veces dependiendo de lo que se valla a realizar:

1. Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la denaturación depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

2. Unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

3. Extensión de la cadena

Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN en la muestra.
Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.

Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento.

Tipos de PCR

PCR anidada

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.

PCR in situ

PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. El PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma viral. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de menor importancia de secuencias.

PCR multiplex

PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción.

RT-PCR

Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario).

PCR tiempo real

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original.

Se puede dividir en las técnicas basadas fluorocromos no específicos y en técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos, el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para RealTime PCR. Permite cuantificar solo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar primers normales para su realización. Es mucho mas económica que la realización de Realtime PCR con sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse), cuando la sonda está intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5′-3′ exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

ADN complementario